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PNAS 深层组织三维化学成像:组织透明化助力拉曼显微镜金夏律

2019-07-14 17:38 出处:未知 人气: 评论(0

  。但是,光学成像技术由于生物组织内折射率的不均匀性,通常只能对组织表层数百微米的范围进行成像。近年来组织透明化技术发展提高了组织成像的深度,使完整器官乃至完整生物体的成像成为可能。然而几乎所有这些透明化方法都是基于荧光显微镜开发的,而对于具有化学选择性的拉曼散射显微镜,其成像深度被在数百微米量级。如果成像深度能增加到毫米量级,拉曼散射成像将提供生物组织内更完整的三维化学信息。

  研究人员为了开发适用于拉曼成像的组织透明化技术,提出了两个评价组织透明化方法的标准。第一个标准是“拉曼透明”:指用于组织透明化的试剂本身不会引入干扰成像的拉曼信号。第二个标准是“结构维持”: 指组织原有的结构在经过透明化之后保持不变。研究人员发现这两个标准实际上常具有挑战性,因为常用的组织透明化试剂——二苄醚、山梨糖醇和果糖——在碳氢拉伸区(2800-3000 cm-1)内具有很强的拉曼信号,而且许多组织透明化方法都通过去除组织中的脂质来减少折射率的不均匀性,了组织内脂质的结构。根据这两个标准,研究人员找到了一个用于组织透明化的——尿素。尿素是组织透明化技术Scale和ScaleS的核心成分。在“拉曼透明”上,尿素在1800 cm-1到 3000 cm-1的 光谱范围内都没有拉曼信号,这得益于尿素只有N-H键而没有C-H键(图1)。在组织结构维持上,组织经过透明化后其在碳氢拉伸区的拉曼峰形几乎没有变化,表明组织里的蛋白和脂质都保存完好(图1)。生物组织浸泡在8 M尿素溶液中会变得透明。这是由于尿素进入高折射率蛋白的疏水内核,使其部分变性、水合。小鼠大脑切片经过透明化后,受激拉曼散射成像的深度在不同脑区提高了5-10倍(图1)。研究人员发现在8 M尿素溶液中加入0.2% Triton X-100会进一步提高成像深度,而且这种透明化试剂也满足“拉曼透明”和组织结构维持这两个标准(图1)。研究人员测定组织透明度在浸泡的第4天进入平台期,使成像深度在大脑皮层增加了17.2倍,在白质增加了13.2倍,在海马体增加了11.4倍(图1)。

  此外,研究人员开发了多光谱受激拉曼散射成像的三维相量分析法,实现了三维组织结构的化学聚类和分割(图2)。研究人员将三维化学成像和分析用于神经生物学和癌症生物学的研究。首先,研究人员发现肿瘤表层的脂质合成会增加,表明在肿瘤侵入正常组织的边界发生着快速的细胞和增殖。第二,研究人员定量测定了多个脑区中血管、轴突和细胞体的分布(图3)。第三,研究人员划定了肿瘤边界,了恶性胶质细胞瘤的复杂三维结构(图4)。第四,研究人员发现和肿瘤主体中的细胞相比,浸润性肿瘤细胞有高的脂质蛋白比,形纤维蛋白表达和高脂质合成速率。第五,研究人员发现相比于正常细胞,肿瘤细胞和血管之间有更紧密的连结,而且,和正常组织中的血管相比,肿瘤中的血管有更高的代谢活性和更多的蛋白和脂质含量(图5)。

  与三维荧光成像技术相比,这项三维化学成像技术具有一些独特的优势。第一,受激拉曼散射成像可以提供样品组成的综合化学信息,识别和区分脂质、蛋白、DNA、糖、磷酸等化学物质。这些物质的分布、种类和构象对其生物功能至关重要。第二,受激拉曼散射成像可以实现无标记成像,免于荧光标记在深层组织中扩散缓慢的困难。第三,生物正交化学成像可以实现对生物在组织和生物体内代谢的动态成像。

  今后这项技术可以在以下几方面做进一步改进。在透明化技术方面,可通过筛选更多的化学进一步增加组织透明度。在仪器方面,这项技术可以结合多通道同步成像技术,实现高通量三维化学成像。在应用方面,可根据特定的成像目的调整适用于拉曼的组织透明化技术。比如,通过结合受激拉曼散射成像和基于水凝胶的组织透明化技术,有可能实现对蛋白质的分布和二级结构的同步成像。总之,结合组织透明化的受激拉曼散射显微技术将被广泛应用于研究组织的三维结构、组成和功能。

  据悉,哥伦比亚大学博士生魏冕和博士后石玲燕(将赴大学分校任助理教授)为文章的共同第一作者,闵玮教授和魏璐教授为文章的共同通讯作者,博士后沈熠晖、博士生赵之仑、博士后Asja Guzman、Laura J. Kaufman教授对此项研究也有重要贡献。

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本文标签: 化学

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